Вспышка Actinobacillus Pleuropneumoniae у свиней в Израиле
Поцци, С.П.,
Июнь 2011
АННОТАЦИЯ
В свиноводческом хозяйстве на 1200 свиноматок смертность выращиваемых и находившихся в группе откорма свиней возросла до 8% с несколькими случаями внезапной смертности от респираторных заболеваний. Повреждения тканей, обнаруженные при вскрытии, являлись признаками инфекции, вызываемой Actinobacillus Pleuropneumoniae (Ann). Легкие, извлечённые при вскрытии, были представлены для лабораторных исследований с целью изоляции возбудителя, его идентификации и проверки чувствительности Ann. Идентификация культур из изолятов и серологические анализы подтвердили, что Ann был причиной вспышки заболевания. Тесты на чувствительность позволили организовать лечение стада, которое снизило смертность в пострадавшем хозяйстве. На сегодняшний день не существует вакцины от Ann , зарегистрированной в Израиле.
ВВЕДЕНИЕ
Ann – это грамотрицательные, не образующие эндоспор, неподвижные, капсулообразующие бактерии, которые вызывают септицемию и плевропневмонию и могут стать причиной смерти или хронически субклинически протекающего заболевания с понижением показателей роста и увеличением расходов на лекарственные препараты. Кроме того, Ann в первую очередь признан вызывающим плеврит и возникновение плевро-париетальных спаек у свиней на скотобойнях.
Распознают два биотипа актинобациллезной плевропневмонии, I и II, в соответствии с различными требованиями к их выращиванию в лабораторных условиях,: I биотип проявляет НАД — зависимость и наличие “подпитки” от Staphylococcus aureus или прожилок эпидермиса. II биотип не требует присутствия Staphylococcus aureus или тонкого слоя эпидермиса и бактериальный биотип легко растет на пластинке с кровянистым агаром (1, 2). С точки зрения капсульных полисахаридов (КПС) и липополисахаридов клеточной оболочки, на сегодняшний день идентифицировано не менее 15 различных серотипов Ann, 13 из которых относятся к I биотипу и два из которых относятся ко II биотипу. Кроме того, известны перекрёстные реакции серотипов из-за сходства в структуре липополисахаридов клеточной оболочки. Гемолитическая активность является одной из основных характеристик роста Ann на пластинке с кровянистым агаром; эта последовательность выделения токсинов, классифицированных как Apx I, Apx II, Apx III, относящихся к повторам группы структурных токсинов с сильными гемолитическими или цитолитическими свойствами.
Ann имеет высокую специфичность для свиней и поражает дыхательные пути, и во время болезни возбудитель может быть выделен из поражений легких и носовых выделений. Инфекция, как правило, закрепляется на уровне стада через производителей (свиноматок), которые заражают поросят во время вскармливания молоком. Зараженные свиноматки также передают через молозиво высокий уровень антител поросятам. У этих поросят редко развивается заболевание, в связи с нейтрализующим действием пассивных антител, вплоть до отъема (в возрасте 4 недель) и даже позже (в возрасте от 6 до 10 недель).
Вероятно, существует тесная связь между инфекцией без клинических признаков и наличием колостральных антител. Позже поросята подвержены распространению Ann при прямом контакте или при передаче инфекции воздушно-капельным путем, но только на коротком расстоянии. Типичные клинические признаки актинобациллезной плевропневмонии наблюдаются, начиная с 10-недельного возраста (примерно от 25 до 30 кг массы тела) до завершающего периода (100 кг массы тела и более). Ann закрепляется вначале на миндалинах, и затем, преодолев очищающую функцию мукоцилиарной системы, локализуется на альвеолярный эпителий. Если Ann фагоцитируется макрофагами, он может выжить в течение определенного периода: КПС и липополисахариды клеточной оболочки обеспечивают устойчивость к активности сывороточного комплемента и Арх токсины ответственны за подавление фагоцитарной функции макрофагов и нейтрофилов.
Таблица 1: Выделение токсинов и сопротивление сывороточного комплемента согласно серотипу (1 модифицированный; 2)
| Сопротивляемость сывороточного комплемента | ||||
| Ток-сины | Серотипы | (ответственная стуктура) | ||
| Apx I | 1, 5, 9, 10, 11, 14 | серотип 1 | Липополисахариды клеточной оболочки | |
| Apx II | 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15 | серотип5 | Капсульные полисахариды | |
| Apx III | 2, 3, 4, 6, 8, 15 | |||
Во время размножения на альвеолярном уровне, Ann сопротивляется фагоцитозу благодаря функции своей плотной капсулы и выделяет токсины, которые усугубляют воспалительный ответ на уровне легких. Токсины оказывают гемолитическое, цитотоксическое, цитолитическое и вызывающее отек действие.
Выделение токсинов различается в соответствии с биотипами и серотипами, как это схематично показано в таблице 1.
Результаты активного размножения Ann в легких вместе с выпущенными токсинами приводят к тяжёлому отёку, кровотечению и некрозу в острейших и острых случаях и альвеолярному и кардиальному отёкам, внутрисосудистому фиброзному тромбозу и некротизирующей плевропневмонии в случаях острого и подострого течения заболевания. Корреляция с высокой вирулентностью связана с выделением двух токсинов или различиями в вирулентности из-за состава капсулы или состава липополисахаридов клеточной оболочки.
Поражения легких могут быть оценены уже через 3 часа после экспериментального инфицирования или после инкубационного периода 8-24 часов при полевых инфекциях. Кромки поврежденных участков хорошо разграничены от окружающей не пораженной легочной ткани; хронические случаи приводят к некротическим остаточным участкам с интенсивным фиброзом, плевральным сращениям различной протяжённости, которые сохраняются до убоя. Токсины вызывают иммунный ответ и циркуляцию нейтрализующих токсинов и действующих против наружного белка мембраны антител, которые могут быть обнаружены 10-14 дней спустя, сохраняясь несколько месяцев. В невакцинированных популяциях обнаружение титров антител, как к токсинам, так к наружному белку мембраны, к липополисахаридам клеточной оболочки или к капсульным полисахаридам, помогает определить эпидемиологию инфекции AПП.
Прошлый опыт распространения серотипов 2 и 9 в популяции свиней в Израиле показал серо-распространенность на 55,8% и 54,2% соответственно среди обследованных животных и на 88% рассмотренных стад. Однако до сих пор, Ann ещё никогда не был выделен из конкретных поражений лёгких и идентифицирован. Цель настоящего документа – представить первую изоляцию штамма Ann от свиней израильской популяции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ферма и животные
Образцы были получены в начале 2010 года из свиноводческого хозяйства с поголовьем около 1200 свиноматок, которое находится в Северном регионе Израиля. Владелец жаловался на увеличение смертности в период набора веса и в завершающий период, с несколькими случаями внезапной смерти и/или случаями острых респираторных заболеваний, которые быстро привели к летальному исходу. Смертность достигла в среднем 8% от количества свиней на откорме и в завершающей фазе ежемесячно.
У умирающих свиней был цианоз, который был заметен на ушах, рыле, подгрудке и животе; с серо-геморрагическими пенистыми истечениями из рыла. (Рис. 1) Вскрытия на ферме выявили ряд случаев интенсивной плевропневмонии, из них 10 односторонних, главным образом в нижних, каудальных долях лёгких, с некротическими очагами, жесткими на ощупь, в некоторых случаях достигающими размера яйца (рис. 2). Трахеи и бронхи содержали ту же серо-геморрагическую пену, которая наблюдалась на уровне рыла. В некоторых случаях наблюдались интенсивные и расширенные плевро-париетальные адгезии, приводившие к разрывам тканей легких во время извлечения легких из грудной клетки. (Рис. 3). Серьезность и летальность болезни, возраст поражённых животных, обширные поражения, выявленные при вскрытии, указывали на предварительный диагноз вспышки Ann.
Образцы тканей
Образцы тканей из 4 легких, собранных в двух разных эпизодах были отправлены в лабораторию для изоляции и проверки чувствительности к антибиотикам. Из общего количества в 30 свиней (10 свиноматок; 10 растущих и 10 свиней на откорме), после иммобилизации в станке-ловушке для фиксации свиней, была набрана кровь из яремной вены, используя вакуумный контейнер без антикоагулянта и новую иглу для каждой свиньи. Образцы крови центрифугировали и отделили сыворотку, заморозили, а затем отправили в Международную лабораторию Интервет в Боксмеере (Нидерланды) для серологических исследований. Размер выборки является достаточным для обнаружения хотя бы одного положительного примера в популяции из 3000 свиней с на 10% ожидаемой распространенностью с уверенностью на 95% (12).
Рис. 1: Интенсивный цианоз; геморрагические истечения из рыла.
Рис. 2: Тяжёлая пневмония и плеврит
Рис. 3: Тяжёлый плеврит на париетальной плевре
Метод культивирования
Посевной материал был подготовлен на агаре МакКонки , триптиказовом соевом агаре с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови и «шоколадном агаре» (содержащем как X, так и V факторы). Изоляты культивировали через 24 часа после инкубации при 37oC только в аэробной среде пластинок с шоколадным агаром.
Колонии, выращенные на шоколадном агаре, были затем внесены в триптиказовый соевый агар с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови с внесённым посевным материалом штриховой культуры Staphyloccocus aureus (S. aureus) и инкубированы 24 часа при 37oC в аэробных условиях.
Поскольку это был первый раз, когда Ann был изолирован в Израиле, изоляцию необходимо было проверить в справочной лаборатории. Для этой цели колонии были залиты на шоколадный агар с добавлением 1% кровянистого агара и инкубированы 24 часа при 37oC. Пластины были опечатаны и три реплики изолята были направлены в Институт здоровья животных «IZS-LER», Брешиа, Италия, для подтверждения и признания правильности изоляции. Для подтверждения штаммов Ann были проведены предварительная биохимическая идентификация и тесты ПЦР.
Идентификация
Три реплики из изолированного штамма были представлены для теста реакции кольцепреципитации. Этот тест основывается на специфической реакции кроличьей антисыворотки и антигена в сравнении с реакциями с известными положительными и отрицательными контрольными сыворотками, протекающими одновременно. Специфический тест ПЦР полученных культур проводился для идентификации выделенных штаммов. Тесты были использованы для получения генетического профиля и определения различий между серотипами Ann.
Серологические исследования
Сыворотки были инактивированы при температуре 56oC в течение 4 минут; затем переданы для проведения “внутреннего” иммуноферментного анализа на ИФА-антитела к apx I, apx II, apx III и антигены белка наружной мембраны. В этом тесте микро-титровальные планшеты были покрыты очищенными антигенами, а затем инкубированы с положительной и отрицательной стандартной и/или эталонной сывороткой и неизвестными израильскими образцами. Разбавленные 1:2 растворы были приготовлены до следующей реакции. Антитела, присутствующие в стандартной и/или эталонной сыворотках и в неизвестных образцах, были определены количественно, используя козий анти-свиной конъюгат пероксидазы и TMB субстрат. Результаты выражены как обратная величина последнего разведения, при котором протекала реакция.
Статистические исследования
Были рассчитаны и оценены средние титры антител для каждой группы животных и стандартное отклонение в каждой группе по отношению к каждому антигену. Титры антител для каждой группы и для каждого антигена сравнивались, используя параметрический t-критерий Стьюдента. Значение p<0,05 считалось значимым.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Культура
На агаре МакКонки и пластинках с кровянистым агаром не наблюдалось никакого роста. Колонии на пластинках с шоколадным агаром были маленькими, серыми, полупрозрачными и гладкими. (Рис. 3). Окрашенные организмы проросли в грамотрицательные коккобактерии. Организмы показали сателлизм к S. aureus (золотистому стафилококку)(Рис. 4 и 5). Колонии на кровянистом агаре показали бета гемолиз (13, 14). Сателлизм к S. aureus указывает на 1, НАД-зависимый биотип ANN. Биохимические анализы и КАМП-тест подтвердили подлинность трех штаммов Ann.
Идентификация
Рис. 4: Посев Ann на шоколадном агаре
Рис. 5: “Сателлизм” Ann: интенсивный рост вдоль полосы S. aureus (верхняя полоса). Ann для роста необходим V фактор. Поскольку ANN не может синтезировать его из кровянистого агара, он, как правило, растёт рядом с полосами стафилококков. Колонии очень малы и полупрозрачны. Рядом с нижней полосой наблюдается меньше колоний, потому что этот штамм AПП больше предпочитает быть сателлитом S. aureus, чем S. epidermidis.
Таблица 2: Средние титры антител и стандартное отклонение (СО) к антигенам токсинов Ann у свиноматок, молодняка и свиней группы откорма
| apx I | apx II | apx III | OMP | |
| СВИНОМАТКИ | 13.6 | 13.8 | 10.2 | 9.1 |
| СО | 0.58 | 0.28 | 0.65 | 0.91 |
| МОЛОДНЯК | 10.4 | 12.3 | 9.0 | 8.7 |
| СО | 1.73 | 2.22 | 1.16 | 1.14 |
| СВИНЬИ ГРУППЫ ОТКОРМА | 10.4 | 13.6 | 9.3 | 8.2 |
| СО | 0.90 | 0.39 | 1.09 | 0.74 |
Серологические исследования
Было выявлено, что все 30 отобранных свиней были серопозитивными на четыре антигена, на которые проводились тесты, и результаты были представлены в таблице 2. Серологические тесты подтвердили рассеянный положительный результат на Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), свиной цирковирус 2 типа (PCV2), и дали отрицательные результаты на вирус гриппа свиней (SIV) подтип Н1N1; Н3N2; H2N2, типичные для израильских свиноводческих хозяйств, как было показано ранее (10, 11, 16).
Исследования чувствительности
Изоляты Ann были чувствительны к тетрациклину, флорфениколу, цефтриаксону, энрофлоксацину, цефкиному и устойчивы к амоксициллину, ампициллину, триметоприму/сульфаметоксазолу.
АНАЛИЗ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Лабораторные исследования подтвердили диагноз AПП инфекций, ожидаемый на основе клинических симптомов респираторных заболеваний и результатов вскрытия трупов животных.
Серологический профильный образец для Ann показал более высокие значения для всех четырёх антигенов у молодняка. Возможно, это связано с продолжающимися процессами сероконверсии у этой категории свиней по сравнению со свиноматками и свиньями группы откорма, у которых серологическая специфичность уже видоизменилась ранее.
Между титрами антител ко всем четырём антигенам Ann у молодняка и свиней группы откорма не было никаких статистических различий (р >0,05), хотя наблюдались статистически значимые различия между свиноматками и молодняком — свиньями группы откорма (сгруппироваными вместе) к антигенам арх I (Р< 0,005); apx III (Р< 0,005); к белку наружной мембраны (р< 0,05) и незначительные к антигену арх II (Р = 0.082). Серотип 13 признан более активным (но не исключительно) в выделении токсинов apx II, так что можно предположить высокий и более равномерный иммунный ответ на этот токсин, с меньшими или без существенных различий в увеличении титров антител, по крайней мере, у животных, через длительное время после контакта с источником заражения и сероконверсии, как в этом случае (Р = 0.082). На самом деле стандартное отклонение (СО) показателей для apx II среди свиноматок и среди группы откорма оказалось ниже, чем стандартное отклонение для молодняка и стандартные отклонения для других трех антигенов Ann в любом возрасте.
Эволюция вспышки заболевания
Несмотря на то, что Ann зарегистрирована в нескольких странах, в Израиле не существует зарегистрированных вакцин, так что меры контроля, в основном, сконцентрированы на антибиотикопрофилактике и терапии.
Результаты, относящиеся к проверке чувствительности позволили отказаться от предположительной терапии и провести специфическое лечение: был добавлен в качестве лекарства тетрациклин, корма на высоте 1,400 мг/кг во время периода отъема; в начале фазы роста и, позднее, в начале фазы откорма. пятидневный курс препарата был проведён каждой группе свиней. Кроме того, цефкином 2 мг/кг один раз в день в течение 3 -5 дней или флорфеникол в дозировке 15 мг /кг каждые 48 часов были применены в качестве индивидуальной терапии пораженных животных. Смертность постепенно снизилась до 2,6 — 2,5% примерно через месяц.