David, D., Pozzi, P.S., Perl, S.
2012
РЕЗЮМЕ
На свиноферме закрытого типа в северном Израиле, на которой размещены 425 свиноматок, зафиксирована вспышка классической чумы свиней (КЧС). Вспышка заболевания привела к потере 267 свиноматок (62,8% фермерской популяции свиноматок), 4 хряков (из 6) и 828 свиней на отращивании/откорме (41,4% от общего числа свиней на ферме). Эти данные получены на основании прямых показателей смертности, частичной отбраковки и неизвестного числа выкидышей. Вспышка КЧС началась среди беременных свиноматок с высокой температуры, цианоза, выкидышей, хромоты, рвоты и случаев смерти (24,8% свиноматок и 33,3% хряков). При вскрытии были отмечены кровоизлияния в париетальную плевру, диафрагму, эпикард и почку; лимфоузлы были гиперемированными и геморрагическими; некротические поражения присутствовали на слизистой тонкого кишечника. Диагноз КЧС был поставлен в Ветеринарном Институте Кимрона методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR) и ИФА – анализа на антитела в сыворотке крови, и ИФА-анализа на антиген в гомогенатах органов. Результаты были подтверждены Референтной Лабораторией в Ганновере, германия, при выполнении ПЦР в режиме реального времени с использованием крови и органов. Филогенетический анализ показал, что последовательности изолятов израильского ВКЧС принадлежали к генотипу 2.1. Молекулярное типирование и сравнение аминокислот с изолятами подгруппы вируса КЧС 2.1 из Юго-Восточной Азии и Европы выявили, что изолят ВКЧС, отвечающий за вспышку вируса в Израиле, генетически наиболее похож на китайский изолят ВКЧС. Возникло подозрение, что вирус был занесен дикими хряками, которые контактировали со свиноматками. Образцы крови и органов, которые взяли у диких хряков, найденных в окрестностях фермы, содержали вирус КЧС. После подтверждения диагноза КЧС были осуществлены меры по устранению клинически больных животных и вакцинации оставшейся популяции в хозяйстве и окружающей области.
Ключевые слова: Классическая лихорадка свиней, свинья, дикая свинья, геморрагический, выкидыш, молекулярный анализ, генотип КЧС 2.1.
ВВЕДЕНИЕ
Классическая чума свиней (КЧС) – острозаразное, полисистемное, геморрагическое вирусное заболевание, вызванное вирусом мукозной болезни с одноцепочечной РНК, принадлежащим к семейству Flaviviridae. КЧС поражает как домашних, так и диких свиней, последние из которых считаются резервуаром этого вируса. Вирус передается перорально-назальным способом, при этом первая репликация вируса происходит на уровне миндалин с последующим пассажем в регионарные лимфоузлы с последующей виремией. Тяжесть заболевания может варьировать от легкой до тяжелой степени, и это может приводить к тяжелым потерям пораженных стад. Клинические проявления КСЧ – лихорадка, интенсивное покраснение кожи, что может развиться в цианоз, отсутствие координации задних конечностей, диарея и пневмония; у беременных животных могут происходить выкидыши.
Распознано три клинические формы КЧС: острая, хроническая и врожденная или пренатальная. При дифференциальном диагнозе следует рассмотреть вероятность африканской чумы свиней (ASF), вирусной диареи крупного рогатого скота (BVD), сальмонеллеза, острой геморрагической септицемии, эризипелоида, стрептококка и лептоспироза. Другие возможные варианты включают отравление кумарином и антикоагулянтами, что также следует учитывать.
Острая форма характеризуется лейкопенией, тромбоцитопенией, диффузными геморрагическими петехиями и экхимозами на коже и в лимофузлах, гортани, мочевом пузыре, почках (диффузные кортикальные поражения; печень — так называемое «индюшиное яйцо») и илеоцекальный клапан. Геморрагическая многоочаговая гиперемия селезенки является типичной, но не всегда присутствует. Лимфоузлы увеличены и являются геморрагическими. Поражения и периваскулярные клеточные инфильтраты присутствуют в центральной нервной системе (ЦНС). Хроническая форма характеризуется некротическими язвенными поражениями (так называемые «узелки») в слепой и толстой кишке, может присутствовать генерализованная деплеция лимфоидных тканей и воспалительные, и геморрагические поражения. Врожденная форма характеризуется микроэнцефалией, гипоплазией мозжечка и легких, и дисмиелинизация ЦНС.
Диагноз основан на изучении патологических и гистопатологических поражений, демонстрации вирусной РНК методом ОТ-ПЦР, иммунофлуоресцентного анализа (IFT) криостатных срезов, выделения вируса и демонстрации специфичной сероконверсии методом ИФА и анализов нейтрализации сыворотки (НС) с индикаторной системой, например, анализ на основе нейтрализующей пероксидазы (NPLA). Диагноз подтверждался Референтной Лабораторией ЕС в Ганновере, Германия, методом ПЦР в режиме реального времени.
Цель этой статьи – описать клинические, иммунологические, патологические, гистопатологические и молекулярные наблюдения, которые получены в ходе анализа вспышки КЧС в северном Израиле на свиноферме закрытого типа рядом с ливанской границей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы
Две мертвые домашние свиньи с инфицированной фермы обследовали после смерти. Брали образцы ткани селезенки, миндалин, лимфоузлов, почек, головного мозга и кишечника для проведения молекулярных, вирусологических и гистопатологических анализов. Для проведения гистопатологического анализа различные органы, погруженные в 10% нейтральный забуференный формальдегид (NBF), фиксировали в парафине, разделяли на срезы толщиной по 4 мкм и окрашивали гемотоксиллином и эозином (H&E). Помимо этого, образцы клинически пораженных животных (среди них домашние свиньи, мертвая беременная свиноматка, дикий хряк) отсылали в Эталонную Лабораторию Содружества (CRL), Ганновер, Германия, для подтверждения ВКЧС. Данные по забору образцов и результаты изложены в Таблице 1 далее.
ОТ-ПЦР
Общий образец РНК, взятый из миндалин, селезенки, лимфоузлов и почек местных свиней, и дикого хряка, извлекали с помощью реактива TRI REAGENT T 118 (TRI REAGENT, Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA) соглаcно инструкциям производителя.
Таблица 1: Результаты образцов анализа образцов с положительным ответом.
Происхождение Антитело ИФА Антиген ИФА ОТ-ПЦР КЧС
Ферма всего полож. на КЧС полож. на BVD всего полож. всего полож. полож.
Сыворотка 24 12 0 0 0
Гомогенат органов 6 5 6 4
1 сомнит. омогенат плодов 1 1
Дикие хряки
Сыворотка 1 1 nt nt nt
Гомогенат органов 1 1 2 2
Всего 25 13 0 8 7 + 1 сомнит. 8 6
nt = не тестировалось
Секвенирование и генетический анализ
Два фрагмента прошедших амплификацию визуалировали на 1,5% агарозных гелях, очищали с помощью агарозной центрифужной колонки GenElute™ (Sigma) и секвенировали с помощью автоматического анализатора ДНК для секвенирования 3700 (Applied Biosystems) согласно инструкциям производителя. Поиск с помощью основного средства поиска локального выравнивания (BLAST). Последовательность 5’ UTR 150 подтвердила идентификацию вируса КЧС. Для выполнения филогенетического анализа осуществлялось выравнивание нуклеотидных последовательностей с помощью программа CLUSTAL X. Филогенетическое дерево 190 bp фрагмента E2 было построено методом объединения соседних пар; расстояние рассчитывали на основании максимального совокупного подобия с помощью компьютерной программы MEGA, версия 3.1. Достоверность филогенетических группировок оценивалась с помощью обобщенной кросс-валидации с помощью 1,000 повторностей.
ИФА
Был проведен непрямой анализ ИФА двадцати четырех образцов от свиноматок с и без клинических признаков на присутствие антител к вирусу КЧС. Проведенные анализы выявили присутствие антител против белка E2 КЧС. Был также проведен анализ ИФА на антитела против вирусной диареи крупного рогатого скота (BVD) с помошью набора для испытания IDEXX BVDV Ab (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA). Был проведен прямой анализ ИФА шести гомогенатов органов свиноматок, одного гомогената органа отторгнутого плода и один органа дикого хряка с целью выявления вирусных антигенов ВКЧС с помощью набора PrioCheck CSF-Ag (Prionics Lelystadt B.V., подразделение Prionics, Zurich, Switzerland).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Вспышка вируса произошла на ферме на севере Израиля, в 3,5 километрах от ливанской границы. Это была свиноферма закрытого типа, в которой содержались 425 свиноматок, 6 хряка и около 2,000 свиней на отращивании/откорме различного возраста. Область, в которой располагается ферма, считается маршрутом перехода для диких хряков. Свиноферма состояла из различных отдельных зданий.
Первые клинические признаки появились в здании, в котором размещаются беременные животные и хряки, расположенном на расстоянии около 70 метров от зданий, используемых для опороса, доращивания и отрашивания/откорма. Ферма не имеет забора или барьеров. Предположительный диагноз классической чумы свиней был поставлен на основании клинических наблюдений и наблюдений при вскрытии, которые изначально как геморрагические поражения внутренних органов, включая почки.
Клинические аспекты
Первые клинические признаки появились 15 февраля 2009 (День 1) у одной свиноматки, недавно оплодотворенной импортированной спермой. У свиноматок наблюдалась слабость, высокая температура (более 41°C) и эритема. Свиноматке поставили диагноз эризипелоида и лечили антибиотиками (комбинация пенициллина – стрептомицина), на что ответа не получили. На следующий день аналогичные симптомы появились у двух других свиноматок, одна из которых умерла в том же загоне. В течение нескольких дней заболели животные всего загона. Через четыре дня произошли первые выкидыши, а у других свиноматок наблюдалась анорексия, эритема, хромота и проблемы с вставанием на ноги и ходьбой, в частности, это отразилось на нижних конечностях.
В День 5 несколько свиноматок оставались в лежащем положении на боку, при этом отмечалось брюшное дыхание, кашель и рвота, включая несколько случаев геморрагической рвоты. У двух хряков наблюдались аналогичные признаки, включая интенсивное покраснение мошонки. Несколько свиноматок умерли в период со Дня 2 до Дня 9. В первых 10 дней клинические признаки наблюдались только у беременных свиноматок; животные, которые находились на опоросе, доращивании, докорме, отращивании/откорме, не имели признаков каких-то особых проблем. У клинически пораженных свиноматок брали образцы крови и образцы органов при вскрытии свиноматок (легкое, лимфоузлы, миндалины, селезенка, печень, почка, центральная нервная система, мышца) и отторгнутых плодов.
Патологическое вскрытие
В Дни 8 и 9 Отдел ветеринарной службы провела первые вскрытия. У мертвых свиноматок отмечалось многоочаговое кровоизлияние и цианоз кожи, который в некоторых случаях поражал всю поверхность тела (Рисунок 1). При вскрытии кровоизлияния и петехии отмечались в брюшной полости, грудной клетке (париетальной плевре) (Рисунке 2) и эпикарде (Рисунке 3), и диафрагме. В легких наблюдалась интерстициальная пневмония с геморрагическими очагами (Рисунок 4); в некоторых случаях отмечался интенсивный и распространенный фибринозный плеврит, возможно вызванный вторичной бактериальной инфекцией. В ряде случаев отмечалось увеличение селезенки. Лимфоузлы были заполнены кровью и увеличены, и неровные кровоизлияния (так называемая «географическая карта» отмечались на срезе поверхности. Многоочаговые геморрагические петехии отмечались на поверхности почки (так называемое «индюшиное яйцо») (Рис. 5) с кортикальными кровоизлияниями на срезе поверхности. В тонком кишечнике отмечались многоочаговые некротические поражения.
В период со Дня 14 до Дня 17, параллельно с описанной вспышкой вируса, были застрелены две очевидно больные свиньи, на расстоянии близко к ферме. В ходе детального обследования ветеринары Управление Природы и Парков Израиля нашли еще 10 мертвых диких хряков, умерших очевидно в различные дни в радиусе 4 км от стада. Образцы крови и органов были взяты для диагностики.
Лабораторные исследования
Лабораторные исследования выполняли для исключения африканской чумы свиней (ASF), синдрома эпидермита-нефрита, вызванного свиным цирковирусом 2 (PCV2), геморрагической септицемией, острой инфекцией Clostridium novyi, и интоксикации афлатоксинами, микотоксинами или ократоксинами. Не проводилось обследования на свиной репродуктивный и респираторный синдрома (PRRS), так как в Израиле не отмечается случаев PRRS.
Рисунок 1. Туловище свиньи: Отметит многоочаговые обширные кровоизлияния и цианоз
Рисунок 2. Многоочаговые петехические и эхимотические кровоизлияния в париетальной плевре.
Рисунок 3. Сердце: Многоочаговые петехические кровоизлияния в эпикарде
Рисунок 4. Многоочаговые петехические кровоизлияния в висцеральной плевре
Рисунок 5. Почка: Многоочаговые петехические кровоизлияния на срезе поверхности коры почки.
Гомогенат органа отторгнутого плода и гомогенат органа дикого хряка были изучены в ходе прямого анализа ИФА для выявления вирусных антигенов ВКЧС с помощью набора PrioCheck CSF-Ag (Prionics Lelystadt B.V., подразделение Prionics, Zurich, Switzerland).
ИФА метод определения антигена
Из восьми изученных образцов семь содержали вирус КЧС (Таблица 1). Этот анализ выявил наличие вируса КЧС в цельной крови, плазме, сыворотке и органах диких хряков.
Гистологическое обследование
Гистологическое обследование различных органов и тканей выявило:
Миндалины: Некротический локальный тонзилит, мононуклеарная инфильтрация и незначительную инфильтрацию некротическими клетками.
Лимфоузлы: деплеция лимфоцитов, некротические очаги в печени и лимфоузлов в поджелудочной железе.
Селезенка: деплеция лимфоцитов, диффузные субкапсулярные и паренхимальные кровоизлияния.
Печень: очаговая инфильтрация мононуклеарными клетками.
Почка: многоочаговые кровоизлияния и многоочаговая инфильтрация мононуклеарными клетками.
Кишечник – подвздошная кишка: некротические очаги на слизистой, деплеция лимфоцитов, наличие фибрина, накопление нейтрофилов и продуктов распада клеток.
Головной мозг: очаговый глиоз, периваскулит, негнойный менинго-энцефалит, некротические очаги.
Мышца: перимизиальные кровоизлияния, некроз мышечных волокон (Рис. 6 a, b).
Молекулярный анализ
Образцы отсылали в Ветеринарный Институт Кимрона для диагностики на ВКЧС, и в день 13 КЧС подтвердили методом ОТ-ПЦР (Рис. 7). Фрагмент гена с 190 парами оснований гликопротеина E2 израильского изолята ВКЧС подвергли молекулярному анализу. Присутствие ВКЧС также подтверждалось анализом BLAST последовательности 150 пар оснований (bp) 5’-UTR, который выявил 98% гомологию между израильскими последовательностями и последовательностями ВКЧС из GenBank (FJ290205, AY072924, AY568569, AF045071, AF045070, L42438, L42437 и AF045069).
Филогенетический анализ израильских последовательностей, последовательностей GenBank и базы данных CRL на основании 190 bp фрагмента гликопротеина ВКЧС E2 позволил определить изоляты израильского ВКЧ от домашних свиней (DP1и DP2) в подгруппу 2.1.
Рисунок 6a.
Рисунок 6b.
Рисунок 7. ОТ-ПЦР вируса КЧС 5’-UTR (300bp) с помощью праймеров F;R для амплификации.
1-селезенка; 2-лимфоузел; 3-миндалина; 4-селезенка; 5-лимфоузел; 6-миндалина; 7-селезенка; 8-миндалина; 9-отрицательный; M -маркер
Последовательности DP1 и DP2 UTR и E2 были посещены в базу данных Genbank (8).
На основании анализа фрагмента 190 bp E2, израильский ВКЧС обладает 99% гомологией к последовательностям ВКЧС DQ907713, FJ529205, EF683606, FJ598642, FJ598610, которые были изоформами от свиней из Китая с 2005-2008. Полученные частичные аминокислотные последовательности гликопротеина E2 изолятов подгруппы
2.1 GenBank сравнивали с последовательностями израильского изолята ВКЧС, они обладали 100% гомологией исключительно с китайскими изолятами.
Поэтому полагают, что возможно израильские и китайские штаммы ВКЧС имеют аналогичный источник происхождения, который вероятно попал в Израиль при путешествии между двумя странами.
Анализ ОТ-ПЦР проведенный в Ганновере, подтвердил наличие ВКЧС в образцах.
ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показатели смертности, которые приписывались КЧС, в период со Дня 1 до Дня 36 в совокупности составили 103 из 425 (24%) свиноматок, 2 из шести хряков (33%) и неизвестное число выкидышей. После серологического и вирусологического подтверждения КЧС Ветеринарные Службы решили принять политику по выбраковке всех клинически больных животных и параллельной вакцинации всех клинически здоровых свиней. Несмотря на тот факт, что ферма, на который осуществлялся анализ изолята, была изолирована от других свиноферм, расположенных поблизости, на расстоянии нескольких километров, расположенных поблизости с местной скотобойней.
С этой целью использовали живую ослабленную вакцину: китайский штамм “CL”, в 100 PD50/доза (2 мл). Племенных животных вакцинировали дважды с 1-месячным интервалом; свиней для отращивания/откорма вакцинировали однократно, в возрасте 7 дней и старше.
Хотя эта вакцина продемонстрировала в ходе экспериментальных исследований по вакцинированию –инфицированию способность по прекращению распространения этого опасного вируса за короткий период (12), настоящая вспышка КЧС быстро не закончилась. Начиная со Дня 45, клинические признаки появились вновь в отделах с животными на доращивании и отращивании/откорме. Клинические признаки появились повторно примерно через 1 месяцев, и до Дню 75 потери в целом составили 123 поросенка на доращивании и 232 животных на отрашивании/откорме, а также нескольких дополнительных свиноматок. Общие потери из-за заболевания и выбраковки составили 267 свиноматок, 4 хряка и 828 свиней на откорме.
Эта вспышка КЧС была первым случаем возникновения КЧС в Израиле за последние 70 лет, поэтому настоящий отчет вносит важный вклад в эпидемиологическую информацию по распространенности КЧС на Ближнем Востоке в целом. Источник вспышки точно не определен, несмотря на подтверждение КЧС у диких хряков.
Топография и дизайн фермы мог поспособствовать контактированию свиноматок и диких хряков. Некоторые из этих аспектов включают:
- Рощи и островки растительности вокруг фермы могли стать приютом для диких животных.
- Ферма по своей схеме, особенно помещение с беременными свиноматками, была сконструирована как большой сарай без заборов и с широкими входами. Поэтому из-за возможности прямого доступа к проходам для свиноматок можно предположить попадание диких хряков внутрь фермы.
Настоящая вспышка КЧС возникла изначально в группе беременных свиноматок и затем через примерно 1 месяц в помещениях с животными на доращивании, отращивании и откорме. Сложно оценить, представляют ли клинические признаки в различных помещениях фермы стадию «позднего развития», как описано в литературных источниками, которая возникла по причине медленной инкубации вируса у некоторых животных (даже животных, прошедших вакцинацию) и распространению от помещения с беременными свиноматками в помещение с животными на доращивании. Следует рассмотреть возможность прямой передачи с сотрудниками при допущении невнимательности при выполнении непосредственных профилактических мер или передачи воздушно-капельным путем в ходе высокоэффективной очистки помещения с беременными свиноматками.
Применение вакцины с целью профилактики не способно полностью предотвратить передачу заболевания в помещениях, где изначально не наблюдалась вспышка заболевания. Однако как уже упоминалось, сложно определить, была ли причиной низкая эффективность или «позднее развитие» клинических признаков у уже инфицированных животных. Более того, следует указать, что применение вакцины не дает возможности разделить вакцинированных и инфицированных животных, как предложено OIE.
Положительные наблюдения по КЧС у диких хряков предполагает возможность вакцинирования с целью профилактики диких хряков с помощью вакцин для применения внутрь. Очевидно, что задача по усовершенствованию мер биобезопасности с помощью ограждений и заборов имеет первостепенно значение в северном Израиле для предотвращения попадания на фермы диких животных.