WAWM

World Association Veterinarians and Microbiologists

Международная Ассоциация Ветеринаров и Микробиологов

Вспышка Actinobacillus Pleuropneumoniae у свиней в Израиле

Поделитесь с друзьями этим материалом

Вспышка Actinobacillus Pleuropneumoniae у свиней в Израиле

Поцци, С.П.,

 

Июнь 2011

 

АННОТАЦИЯ

В свиноводческом хозяйстве на 1200 свиноматок смертность выращиваемых и находившихся в группе откорма свиней возросла до 8% с несколькими случаями внезапной смертности от респираторных заболеваний. Повреждения тканей, обнаруженные при вскрытии, являлись признаками инфекции, вызываемой  Actinobacillus Pleuropneumoniae (Ann). Легкие, извлечённые при вскрытии, были представлены для лабораторных исследований с целью изоляции возбудителя, его идентификации и проверки чувствительности Ann. Идентификация культур из изолятов и серологические анализы подтвердили, что Ann  был причиной вспышки заболевания. Тесты на чувствительность позволили организовать лечение стада, которое снизило смертность в пострадавшем хозяйстве. На сегодняшний день не существует вакцины от Ann , зарегистрированной в Израиле.

 

ВВЕДЕНИЕ

Ann – это грамотрицательные, не образующие эндоспор, неподвижные, капсулообразующие бактерии, которые вызывают септицемию и плевропневмонию и могут стать причиной смерти или хронически субклинически протекающего заболевания с понижением показателей роста и увеличением расходов на лекарственные препараты. Кроме того,  Ann в первую очередь признан вызывающим плеврит и возникновение плевро-париетальных спаек у свиней на скотобойнях.

Распознают два биотипа актинобациллезной плевропневмонии, I и II, в соответствии с  различными требованиями к их выращиванию в лабораторных условиях,: I биотип проявляет НАД — зависимость и наличие “подпитки” от Staphylococcus aureus или прожилок эпидермиса. II биотип не требует присутствия Staphylococcus aureus или тонкого слоя эпидермиса и бактериальный биотип легко растет на пластинке с кровянистым агаром (1, 2). С точки зрения капсульных полисахаридов (КПС) и  липополисахаридов клеточной оболочки, на сегодняшний день идентифицировано не менее 15 различных серотипов  Ann, 13 из которых относятся к I биотипу и два из которых относятся ко II биотипу. Кроме того, известны перекрёстные реакции серотипов из-за сходства в структуре липополисахаридов клеточной оболочки. Гемолитическая активность является одной из основных характеристик роста  Ann на пластинке с кровянистым агаром; эта последовательность выделения токсинов, классифицированных как Apx I, Apx II, Apx III, относящихся к повторам группы структурных токсинов  с сильными гемолитическими или цитолитическими свойствами.

Ann имеет высокую специфичность для свиней и поражает дыхательные пути, и во время болезни возбудитель может быть выделен из поражений легких и носовых выделений. Инфекция, как правило, закрепляется на уровне стада через производителей (свиноматок), которые заражают поросят во время  вскармливания молоком. Зараженные свиноматки также передают  через молозиво высокий уровень антител поросятам. У этих поросят редко развивается заболевание, в связи с нейтрализующим действием пассивных антител, вплоть до отъема (в возрасте 4 недель) и даже позже (в возрасте от 6 до 10 недель).

Вероятно, существует тесная связь между инфекцией без клинических признаков и наличием колостральных антител. Позже поросята подвержены распространению  Ann при прямом контакте или при передаче инфекции воздушно-капельным путем, но только на коротком расстоянии. Типичные клинические признаки актинобациллезной плевропневмонии наблюдаются, начиная с 10-недельного возраста (примерно от 25 до 30 кг массы тела) до завершающего периода (100 кг массы тела и более). Ann закрепляется вначале на миндалинах, и затем, преодолев очищающую функцию мукоцилиарной системы, локализуется на альвеолярный эпителий. Если  Ann фагоцитируется макрофагами, он может выжить в течение определенного периода: КПС и липополисахариды клеточной оболочки обеспечивают устойчивость к активности сывороточного комплемента и Арх токсины ответственны за подавление фагоцитарной функции макрофагов и нейтрофилов.

Таблица 1: Выделение токсинов и сопротивление сывороточного комплемента согласно серотипу (1 модифицированный; 2)

Сопротивляемость сывороточного комплемента
Ток-сины Серотипы (ответственная стуктура)
Apx I 1, 5, 9, 10, 11, 14 серотип 1 Липополисахариды клеточной оболочки
Apx II 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15 серотип5 Капсульные полисахариды
Apx III 2, 3, 4, 6, 8, 15

Во время размножения на альвеолярном уровне, Ann сопротивляется фагоцитозу благодаря функции своей плотной капсулы и выделяет токсины, которые усугубляют воспалительный ответ на уровне легких. Токсины оказывают гемолитическое, цитотоксическое, цитолитическое и вызывающее отек действие.

Выделение токсинов различается в соответствии с биотипами и серотипами, как это схематично показано в таблице 1.

Результаты активного размножения  Ann в легких вместе с выпущенными токсинами приводят к тяжёлому отёку, кровотечению и некрозу в острейших и острых случаях и альвеолярному и кардиальному отёкам, внутрисосудистому фиброзному тромбозу и некротизирующей плевропневмонии в случаях острого и подострого течения заболевания. Корреляция с высокой вирулентностью связана с выделением двух токсинов или различиями в вирулентности из-за состава капсулы или состава липополисахаридов клеточной оболочки.

Поражения легких могут быть оценены уже через 3 часа после экспериментального инфицирования или после инкубационного периода 8-24 часов при полевых инфекциях. Кромки поврежденных участков хорошо разграничены от окружающей не пораженной легочной ткани; хронические случаи приводят к некротическим остаточным участкам с интенсивным фиброзом, плевральным сращениям различной протяжённости, которые сохраняются до убоя. Токсины вызывают иммунный ответ и циркуляцию нейтрализующих токсинов и  действующих против наружного белка мембраны антител, которые могут быть обнаружены 10-14 дней спустя, сохраняясь несколько месяцев. В невакцинированных популяциях обнаружение титров антител, как к токсинам, так к наружному белку мембраны,  к липополисахаридам клеточной оболочки или к  капсульным полисахаридам, помогает определить эпидемиологию инфекции AПП.

Прошлый опыт распространения серотипов 2 и 9 в популяции свиней в Израиле показал серо-распространенность на 55,8% и 54,2% соответственно среди обследованных животных и на 88% рассмотренных стад. Однако до сих пор,  Ann ещё никогда не был выделен из конкретных поражений лёгких и идентифицирован. Цель настоящего документа – представить первую изоляцию штамма  Ann от свиней израильской популяции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ферма и животные

Образцы были получены в начале 2010 года из свиноводческого хозяйства с поголовьем около 1200 свиноматок, которое находится в Северном регионе Израиля. Владелец жаловался на  увеличение смертности в период набора веса и в завершающий период, с несколькими случаями внезапной смерти и/или случаями острых респираторных заболеваний, которые быстро привели к летальному исходу. Смертность достигла в среднем 8% от количества свиней на откорме и в завершающей фазе ежемесячно.

У умирающих свиней был цианоз, который был заметен на ушах, рыле, подгрудке и животе; с серо-геморрагическими пенистыми истечениями из рыла. (Рис. 1) Вскрытия на ферме выявили ряд случаев интенсивной плевропневмонии,  из них 10 односторонних, главным образом в нижних, каудальных долях лёгких, с некротическими очагами, жесткими на ощупь, в некоторых случаях достигающими размера яйца (рис. 2). Трахеи и бронхи содержали ту же серо-геморрагическую пену, которая наблюдалась на уровне рыла. В некоторых случаях наблюдались интенсивные и расширенные плевро-париетальные адгезии, приводившие к разрывам тканей легких во время извлечения легких из грудной клетки. (Рис. 3). Серьезность и летальность болезни, возраст поражённых животных, обширные поражения, выявленные при вскрытии, указывали на предварительный диагноз вспышки  Ann.

Образцы тканей

Образцы тканей из 4 легких, собранных в двух разных эпизодах были отправлены в лабораторию для изоляции и проверки чувствительности к антибиотикам. Из общего количества в 30 свиней (10 свиноматок; 10 растущих и 10 свиней на откорме), после иммобилизации в станке-ловушке для фиксации свиней, была набрана кровь из яремной вены, используя вакуумный контейнер без антикоагулянта и новую иглу для каждой свиньи. Образцы крови центрифугировали и отделили сыворотку, заморозили, а затем отправили в Международную лабораторию Интервет в Боксмеере (Нидерланды) для серологических исследований. Размер выборки является достаточным для обнаружения хотя бы одного положительного примера в популяции из 3000 свиней с на 10% ожидаемой распространенностью с  уверенностью на 95% (12).

85afd4ac0a0e7da7b9e4339648c68499

Рис. 1: Интенсивный цианоз; геморрагические истечения из рыла.

900cd0c3f45b7b8e1619a53573a6a982

Рис. 2: Тяжёлая пневмония и плеврит

79ef458f4682c2ff80311a4c4b6c93c3

Рис. 3: Тяжёлый плеврит на париетальной плевре

Метод культивирования

Посевной материал был подготовлен на агаре МакКонки , триптиказовом соевом агаре с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови и «шоколадном агаре» (содержащем как X, так и V факторы). Изоляты  культивировали через 24 часа после инкубации при 37oC только в аэробной среде пластинок с шоколадным агаром.

Колонии, выращенные на шоколадном агаре, были затем внесены в триптиказовый соевый агар с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови с внесённым  посевным материалом штриховой культуры Staphyloccocus aureus (S. aureus) и инкубированы  24 часа при 37oC в аэробных условиях.

Поскольку это был первый раз, когда  Ann был изолирован в Израиле, изоляцию необходимо было проверить в  справочной лаборатории. Для этой цели колонии были залиты на шоколадный агар с добавлением 1% кровянистого агара и инкубированы 24 часа при  37oC. Пластины были опечатаны и три реплики изолята были направлены в Институт здоровья животных «IZS-LER», Брешиа, Италия, для подтверждения и признания правильности изоляции. Для подтверждения штаммов  Ann были проведены предварительная биохимическая идентификация и тесты ПЦР.

Идентификация

Три реплики из изолированного штамма были представлены для теста реакции кольцепреципитации. Этот тест основывается на специфической реакции кроличьей антисыворотки и антигена в сравнении с реакциями с известными положительными и отрицательными контрольными сыворотками, протекающими одновременно. Специфический тест ПЦР полученных культур проводился для идентификации выделенных штаммов. Тесты были использованы для получения генетического профиля и определения различий между  серотипами  Ann.

Серологические исследования

Сыворотки были инактивированы при температуре 56oC в течение 4 минут; затем переданы для проведения “внутреннего” иммуноферментного анализа на ИФА-антитела к  apx I, apx II, apx III и антигены белка наружной мембраны. В этом тесте микро-титровальные планшеты были покрыты очищенными антигенами, а затем инкубированы с положительной и отрицательной стандартной и/или эталонной сывороткой и неизвестными израильскими образцами. Разбавленные 1:2 растворы были приготовлены до следующей реакции. Антитела, присутствующие в стандартной и/или эталонной сыворотках и в неизвестных образцах, были определены количественно, используя козий анти-свиной конъюгат пероксидазы и TMB субстрат. Результаты выражены как обратная величина последнего разведения, при котором протекала реакция.

Статистические исследования

Были рассчитаны и оценены средние титры антител для каждой группы животных и стандартное отклонение в каждой группе по отношению к каждому антигену. Титры антител для каждой группы и для каждого антигена сравнивались, используя параметрический t-критерий Стьюдента. Значение p<0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Культура

На агаре МакКонки и пластинках с кровянистым агаром не наблюдалось никакого роста. Колонии на пластинках с шоколадным агаром были маленькими, серыми, полупрозрачными и гладкими. (Рис. 3). Окрашенные организмы проросли в грамотрицательные коккобактерии. Организмы показали сателлизм к S. aureus (золотистому стафилококку)(Рис. 4 и 5). Колонии на кровянистом агаре показали бета гемолиз (13, 14). Сателлизм к S. aureus указывает на 1, НАД-зависимый биотип ANN. Биохимические анализы и КАМП-тест подтвердили подлинность трех штаммов Ann.

 

Идентификация

4580be33edd4ec7b2c2e45bf0558d25d

Рис. 4: Посев Ann на шоколадном агаре

dca6bb26967b2c53acde6d82380f7261

Рис. 5: “Сателлизм”  Ann: интенсивный рост вдоль полосы  S. aureus (верхняя полоса).  Ann для роста необходим V фактор. Поскольку ANN не может синтезировать его из кровянистого агара, он, как правило, растёт рядом с полосами стафилококков. Колонии очень малы и полупрозрачны. Рядом с нижней полосой наблюдается меньше колоний, потому что этот штамм AПП больше предпочитает быть сателлитом S. aureus, чем S. epidermidis.

Таблица 2: Средние титры антител и стандартное отклонение (СО) к антигенам токсинов Ann  у свиноматок, молодняка и свиней группы откорма

apx I apx II apx III OMP
СВИНОМАТКИ 13.6 13.8 10.2 9.1
СО 0.58 0.28 0.65 0.91
МОЛОДНЯК 10.4 12.3 9.0 8.7
СО 1.73 2.22 1.16 1.14
СВИНЬИ ГРУППЫ ОТКОРМА 10.4 13.6 9.3 8.2
СО 0.90 0.39 1.09 0.74

 

 

Серологические исследования

Было выявлено, что все 30 отобранных свиней были серопозитивными на четыре антигена, на которые проводились тесты, и результаты были представлены в таблице 2. Серологические тесты подтвердили рассеянный положительный результат на Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), свиной цирковирус 2 типа (PCV2), и дали отрицательные результаты на вирус гриппа свиней (SIV) подтип Н1N1; Н3N2; H2N2, типичные для израильских свиноводческих хозяйств, как было показано ранее (10, 11, 16).

Исследования чувствительности

Изоляты Ann были чувствительны к тетрациклину, флорфениколу, цефтриаксону, энрофлоксацину, цефкиному и устойчивы к амоксициллину, ампициллину, триметоприму/сульфаметоксазолу.

АНАЛИЗ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лабораторные исследования подтвердили диагноз AПП инфекций, ожидаемый на основе клинических симптомов респираторных заболеваний и результатов вскрытия трупов животных.

Серологический профильный образец для  Ann показал более высокие значения для всех четырёх антигенов у молодняка. Возможно, это связано с продолжающимися процессами сероконверсии у этой категории свиней по сравнению со свиноматками и свиньями группы откорма, у которых серологическая специфичность уже видоизменилась  ранее.

Между титрами антител ко всем четырём антигенам  Ann у молодняка и свиней группы откорма не было никаких статистических различий (р >0,05), хотя наблюдались статистически значимые различия  между свиноматками и молодняком — свиньями группы откорма (сгруппироваными вместе) к антигенам арх I (Р< 0,005); apx III (Р< 0,005); к белку наружной мембраны (р< 0,05) и незначительные к антигену арх II (Р = 0.082). Серотип 13 признан более активным (но не исключительно) в выделении токсинов apx II, так что можно предположить высокий и более равномерный иммунный ответ на этот токсин, с меньшими или без существенных различий в  увеличении титров антител, по крайней мере, у животных, через длительное время после контакта с источником заражения и сероконверсии, как в этом случае (Р = 0.082). На самом деле стандартное отклонение (СО) показателей для apx II среди свиноматок и среди группы откорма оказалось ниже, чем стандартное отклонение для молодняка и стандартные отклонения для других трех антигенов  Ann в любом возрасте.

Эволюция вспышки заболевания

Несмотря на то, что Ann зарегистрирована в нескольких странах,  в Израиле не существует зарегистрированных вакцин, так что меры контроля, в основном, сконцентрированы на антибиотикопрофилактике и терапии.

Результаты, относящиеся к проверке чувствительности позволили отказаться от предположительной терапии и провести специфическое лечение:  был добавлен в качестве лекарства тетрациклин, корма на высоте 1,400 мг/кг во время периода  отъема; в начале фазы роста и, позднее, в начале фазы откорма. пятидневный курс препарата был проведён каждой группе свиней. Кроме того,  цефкином 2 мг/кг один раз в день в течение 3 -5 дней или флорфеникол в дозировке 15 мг /кг каждые 48 часов были применены в качестве индивидуальной терапии  пораженных животных. Смертность постепенно снизилась до 2,6 — 2,5% примерно через месяц.

 


Поделитесь с друзьями этим материалом

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *