Количественная ПЦР (кПЦР) — это распространенный метод количественного определения нуклеиновых кислот в биологических образцах и образцах из окружающей среды. Хотя многие исследователи считают этот метод относительно простым, существует ряд этапов и реагентов, которые требуют оптимизации и проверки для обеспечения воспроизводимости и получения точных данных. Соответственно, плохо оптимизированные реакции могут привести к неправильной интерпретации или результатам, которые трудно воспроизвести.
Общие проблемы в рабочих процессах количественной ПЦР
Количественная ПЦР — невероятно чувствительный способ измерения экспрессии генов, но эта чувствительность делает метод восприимчивым к системным ошибкам из-за небольших технических ошибок или контаминации реакции. Ошибки пипетирования приобретают большее значение в рабочих процессах количественной ПЦР, как и расхождения в использовании различных праймерах или реагентах. Например, новые наборы праймеров могут иметь другую эффективность, чем старые наборы, а старые или некачественные реагенты могут привести к несоответствиям между анализами количественной ПЦР. Другая распространенная проблема возникает когда один термоциклер находится в пользовании нескольких исследователей. Обычно они вносят различные протоколы для разных мишеней, и в результате могут сравнивать или путать реакции между собой, выполняемые последовательно.
Преодоление проблем с кПЦР.
Хотя кПЦР требует определенного опыта, чтобы избежать проблем с контаминацией или воспроизводимостью результатов, есть простые шаги, которые исследователь может предпринять, чтобы избежать этих и других распространенных проблем.
Один полезный обходной путь состоит в том, чтобы разделить рабочий процесс кПЦР на две комнаты: одну для очистки проб и другую для проведения кПЦР.
Пипеторы являются основным источником загрязнения в рабочих процессах количественной ПЦР. Лучший способ предотвратить контаминацию при пипетировании — иметь наборы для каждой комнаты, которые обеззараживают между пользователями.
Соответствующее защитное оборудование помогает предотвратить загрязнение при работе с жидкостями. Исследователи должны менять перчатки между каждым этапом рабочего процесса и использовать поршневые пипеторы с устойчивыми к аэрозолям наконечниками с фильтром, чтобы предотвратить образование аэрозоля вблизи места реакции.
Дезинфекция поверхности также важна. 70% этанол эффективно очищает рабочие поверхности до и после настройки и проведения количественной ПЦР. Периодическая очистка с помощью ультрафиолетом помогает очистить оборудование от контаминации ДНК/РНК оборудования.
Пробирки с низкой ретенцией помогают обеспечить лучшую воспроизводимость результатов между циклами. Эти пробирки имеют низкое связывание нуклеиновых кислот, что особенно важно при работе с сериями разведений.
Важно использовать соответствующие буферы для разведений, так как разбавление водой может привести к деградации биологических растворов. Исследователи также должны рассмотреть вопрос о нейтрализации воды перед ее использованием в смеси для количественной ПЦР. Вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC), которая часто используется в реакциях количественной ПЦР для инактивации ферментов РНКазы, может быть слегка кислой.
При получении нового набора праймеров для ПЦР исследователи должны оптимизировать реакции количественной ПЦР, подготавливая стандартную пятиточечную калибрационную кривую с 10-кратными разведениями. Эффективность ПЦР должна быть не менее 90%. Исследователи могут оптимизировать другие параметры количественной ПЦР, включая температуру отжига, количество циклов и дизайн праймера. Часть процесса оптимизации должна включать определение правильного количества РНК для использования в каждой реакции.
Использование контроля без биологической пробы (Non template control) для каждой реакции количественной ПЦР помогает оценить уровни загрязнения кДНК или гДНК. Контрольные образцы без обратной транскрипции (NRT) также важны для оценки уровней загрязнения гДНК (геномное ДНК) (в экспериментах где важно отличить между РНК и ДНК в качестве исходного материала).
References
- S.C. Taylor et al., “The ultimate qPCR experiment: Producing publication quality, reproducible data the first time,” Trends Biotechnol, 37(7): 761-74, 2019.
- S.A. Bustin et al., “The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments,” Clin Chem, 55(4):611-22, 2009.