Кауфман Н. и Д.Элад
Абстракт
Паратуберкулез, вызванный Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) – это преимущественно болезнь жвачных животных. Микроорганизм выделяется в фекалиях пораженных животных, даже без клинических признаков. Молодые животных, в возрасте до 6 месяцев сильно подвержены риску инфицирования оральным путем через загрязнение фекалиями. В Израиле не существует ни лечения, ни вакцинации от этого заболевания. Стандартный метод снижения инфекции на ферме заключается в улучшении контроля гигиены и выбраковке коров выделяющих бактерию с калом (более чем 104 копии hspX гена). Следовательно, быстрое выявление животных, выделяющих MAP имеет кардинальное значение в ликвидации инфекции. Целью данного предварительного исследования было разработать протокол отбора проб фекальных испражнений, которые бы максимально увеличили вероятность обнаружения MAP у коров и оценить влияние индуцированного стресса на снижение отела. В исследование были включены 16 коров и 15 телок, выращенных на ферме и от 350 коров, с 10% положительным молоком на MAP ELISA. Пробы ректальных испражнений отбирались на протяжении 5-7 дней, до и после отела, и были исследованы количественной ПЦР (кПЦР). Результаты показывают, что микроорганизмы регулярно выделялись от положительных животных и количественные вариации были минимальны. Следовательно, один образец является хорошим индикатором выделения микроорганизмов. Было выявлено, что выделение МАР не связано со стрессом при отеле.
Ключевые слова: фекальные испражнения, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, количественная ПЦР, выделение.
ВВЕДЕНИЕ
Паратуберкулез (болезнь Йоне), вызванная Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) – преимущественно болезнь жвачных животных, но может повлиять и на других животных.
МАР вызывает существенный экономический вред из-за необходимости отбраковывать животных, которые выделяют микроорганизм или клинически больных животных и у которых присутствуют косвенно инфекционные действия, такие как снижение рождаемости и производительности.
Заболевание распространено по всему миру, его распространённость увеличивается со временем, только 26 стран избавились от этой болезни. В Израиле, из 189 исследованных ферм, около 66% имеют положительный результат (неопубликованные данные).
После выделения МАР от человека, страдающего болезнью Крона (БК), было сделано предположение о том, что эти микроорганизмы участвуют в появлении этого синдрома в качестве возбудителя или вторичной инфекцией, которая усугубляет эти симптомы, споры по этому поводу продолжаются до сих пор.
Молодые животные в возрасте до 6 месяцев наиболее подвержены риску инфицирования и только у 10% из инфицированных животных будут проявляться клинические признаки. Наиболее распространенным является фекально-оральный путь заражения, хотя возможны и другие пути передачи. Микроорганизм попадает в слизистую кишечника в большинстве, но не всегда через лимфатическую ткань (пейеровы бляшки). Образуются очаги инфекции, некоторые из которых будут чисты от бактерий, в то время как другие будут источником дальнейшего распространения и формирования новых очагов. В местах постоянной инфекции происходит гранулематозная реакция, но она не ограничивает распространение микроорганизмов в окружающие ткани. Первоначальная клеточная реакция изменяется через 2 или больше лет после того, как она была неэффективной. При этом выделение с фекальными испражнениями может увеличиться. Кишечные поражения вызывают утолщение кишечной стенки и вызывают недостаточность всасывания.
Клинически выделяют 4 стадии инфекции: а) латентная: без клинических признаков, выделения микроорганизма или антител, б) субклиническая: с клеточным иммунным ответом и выделением м/о, с) клиническая: характеризуется снижением веса (несмотря на нормальное питание), снижение клеточного и повышение гуморального иммунного ответа выделение MAP и г) расширенная клиническая: с интенсивной диареей, развитием отеков и массивное выделение MAP. Примерно 10% пораженных животных достигают этой стадии.
В последнее время была предложена классификация коров по интенсивности выделения м/о:
А) Отрицательная
Б) Пассивное выделение – коровы, выделяют небольшое количество м/о после воздействия с загрязненной окружающей средой без заполнения всего желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)
С) Активное выделение – с колонизацией в ЖКТ
Г) Очень сильное выделение (супер-выделители) – коровы, которые выделяют более, чем 10000 бактерий/гр фекалий. Эта группа представляет на сегодняшний день самый большой риск, выступающий в качестве источника распространения инфекции и поэтому ее необходимо идентифицировать и исключить из стада.
Лабораторная идентификация животных, зараженных МАР проводится либо методами оценки наличия иммунной реакции, либо путем индикации наличия бактерий или их субклеточных компонентов в фекалиях. У каждого из этих методов есть свои недостатки: у первого – неудовлетворительная специфичность (для определения клеточного ответа) или чувствительность (из-за относительно поздних стадий заболевания, в которых продуцируются антитела), тогда как чувствительность второго метода сложно определить из-за нерегулярного выделения МАР в фекальных испражнениях.
Это предварительное исследование направлено на выявление способа отбора проб для индикации МАР таким образом, чтобы можно было определить оптимальное количество и время образца фекальных испражнений для повышения вероятности определения выделения у коров. Кроме того, были оценены два параметра, которые могут влиять на выделение МАР: возраст и индуцированный стресс из-за отела. Была использована методика кПЦР направлена на определение hspX гена, специфичного для МАР. Было обнаружено, что этот метод, по сравнению с культивированием микроорганизмов, значительно короче (1-2 дня против 6-8 недель).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Молочные или сывороточные антитела у коров и телок соответственно, оценивали с помощью ELISA (ID Screen, IDvet, Grabels, Франция). Был проведена проверка на молочной ферме, на которой находилось 350 лактационных коров, 10% из которых показали положительные молочные антитела. В течении 5-7 дней были отобраны 15 телок, две из которых были серопозитивные в течение последнего триместра до и после первых двух недель отела. В соответствии с аналогичным протоколом были отобраны 16 коров, 15 из которых были МАР положительные молочные антитела. Ни одно животное не показывало клинических признаков паратуберкулеза. Образцы заморозили при температуре -18°C и все образцы данной серии были исследованы в одно и тоже время с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), на основании определения hspX гена.
Результаты образцов до и после отела статистически сравнили с помощью двустороннего парного критерия.
Уровни антител и значения кПЦР до и после отела сравнивали с помощью функции Коррела в Microsoft Excel@. Для того, чтобы оценить обусловлена ли наблюдаемая изменчивость в результатах кПЦР одних серий неравномерным распределением микроорганизмов в образце или различиями в уровнях выделения, для этого были исследованы 6 образцов от 3х коров 5-6 раз каждая.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты показали, что вариабельность выделений МАР была не высокая. Сравнение животных до и после отела показали, что каждая из трех коров которые были: положительная, с низким выделением и отрицательным соответственно, были такими до и после отела. Одна корова была положительна до отела, но стала отрицательная спустя 3 месяца после отела. Пять коров, все негативные были доступны только для одной серии тестирования. Среди телок, две были серопозитивными на МАР. У всех телок было обнаружено отрицательное или низкое выделение после отела. Спустя 9 месяцев, одна из серопозитивных телок стала очень сильно выделять м/о и была удалена из стада.
Не было обнаружено никаких существенных статистических различий между уровнями выделения до и после отела (p=0.3374 для телок и p=0.1482 для коров). Коэффициент корреляции был низким (0.20-0.27).
Были исследованы десять образцов из отрицательных в анамнезе (серологически и клинически) на паратуберкулез и они продолжили показывать полностью отрицательные результаты.
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты тестов кПЦР показали, что вариабельность образцов была минимальна и следовательно, расхождения, вероятно, являются результатом различий в уровнях выделений. Выводами этого предварительного исследованиями являются то, что в отличии от того, что сообщалось ранее, уровни выделений МАР в фекальных испражнениях, с некоторыми исключениями, достаточно постоянны для классификации животных как отрицательные, с низким выделением, позитивные с высоким выделением (супер-выделение), по одному образцу. Можно использовать кПЦР для оценки состояния заражения стада, вместо того, как нам известно, однородность выделения МАР в фекальных испражнениях до сих пор оценивали путем культивирования микроорганизма. Кроме того, результаты показали, что стресс, связанный с отелом не влияет на уровни выделения МАР и, что распределение микроорганизмов в образцах фекальных испражнений достаточно гомогенно, чтобы по одному тесту кПЦР определить уровни выделения МАР.
45% (64/142) и 67% (100/149) из образцов от коров и телок, соответственно, показали низкие кПЦР результаты ( Так как набор правильно определил образцы фекальных испражнений с отрицательной фермы, мы предполагаем, что это предположение верно.
По нашему мнению эти низкие значения кПЦР должны быть интерпретированы в свете статуса стада: в стадах с высоким выделением эти результаты указывают скорее всего на пассивное выделение из-за сильного воздействия окружающей среды, тогда как в стадах с низким выделением такие результаты могут указывать на то, что животные находятся на начальных этапах выделения, что можно периодически проверять для определения возможного перехода в более массивное выделение.
Это исследование было в стаде с ограниченным количеством животных. Поэтому мы рекомендуем, чтобы наши заключения в будущем стали основой для расширения количества исследуемых животных.
ВЫВОДЫ
Наши результаты показывают, что:
а) вариабельность уровня выделения МАР в течении 5-7 последовательных дней была низкой и достаточно одного образца, чтобы определить состояние выделения.
б) стресс отела не влияет на уровни выделения, ни до отела ни после.
в) низкие результаты кПЦР указывают на низкие уровни выделения. Эти результаты могут указывать на пассивное выделение или инфекцию.